生物學檢測方法研究生物活性物質之間相互作用及其影響，或者利用生物活性物質之間相互作用進行定量，是生命科學研究領域和藥物研發過程中必不可少的工具。有別于色譜質譜拉曼光譜等儀器分析方法，生物學檢測方法往往是間接的，其間接性導致方法可靠性，穩定性等相對于儀器分析方法較差。從整體宏觀的角度了解生物學檢測方法的間接性是建立一個穩定的生物學檢測方法的關鍵因素之一。

儀器分析方法(a)研究的是樣品本身直接相關的特性，如樣品的分子量大小，樣品的電荷等；與此相對，生物學檢測方法（b）首先要存在或者建立一個Test system，然后加入樣品反應，檢測樣品引起Test system的變化，其檢測和樣品本身是間接相關，檢測目標分子實體不是樣品本身，這是其檢測目標的間接性。如某藥物對腫瘤細胞的殺傷實驗，Test system為細胞，引起的變化是細胞的死亡，檢測目標分子實體為代表活細胞的ATP濃度或者代表死細胞的LDH濃度。 

大多數生物學檢測方法存在一個復雜的Test system，樣品引起Test system的變化也需要在溫和的條件下進行，這使得目標分子很難進行有效的分離并采用儀器分析方法進行檢測，需要引入熒光標記抗體，酶標抗體，或酶催化底物等和目標分子進行反應轉換成信號值，建立信號值和目標分子的間接聯系，這是檢測信號傳遞的間接性。如下圖所示，在一個ELISA直接法的實驗中，樣品是抗體，檢測體系是抗原，引起的變化目標分子抗體-抗原偶聯物，而信號值代表的是TMB催化產物，TMB催化產物經過酶標抗體和目標分子抗體-抗原偶聯物發生間接聯系，一個ELISA方法的質量是由信號在間接的傳遞過程中是否和目標分子抗體-抗原偶聯物線性相關決定的。相關研究請參閱小編之前的文章ELISA常用原理類型方法和常見問題匯總

生物學功能評價和檢測分析方法的雙重間接性為檢測目標的間接性和檢測信號傳遞的間接性。即使最為簡單的生物學檢測方法，配體受體結合實驗在實際的應用過程中由于這兩重的間接性導致其方法也變得無比復雜，存在很多的變量，很容易出現假陽性或者假陰性的結果。一個檢測方法在方法開發的初期往往需要進行分步的實驗來優化方法的可靠性和穩定性，并對建立的方法進行初步的方法學驗證。明確需要檢測的目標分子，信號和目標分子的關聯途徑是進行方法學開發，數據解讀和問題排查的基礎。

一般來講，競爭法實驗主要涉及到三個物質，受體，配體和阻斷配體受體結合的樣品，如PD1受體，PD-L1配體，阻斷劑keyturda抗體，也常采用抗原，生物素化抗體，和阻斷抗原，生物素化抗體的樣品抗體組合。在競爭法開發的初期是建立起受體，配體相互作用的Test system。Test system的條件直接決定了競爭法實驗的準確度和測量范圍。具體到ELISA競爭法方法開發上，主要包含兩個方面：

1.設置多個陰性陽性對照組，確認實驗信號值是真實代表目標分子配體受體偶聯物。主要考察的是在間接的檢測過程中ELISA反應過程采用的酶標板材，酶聯抗體和顯色液等試劑耗材是否干擾Test system。如下圖所示，嚴格來講在新建一個ELISA方法時，需要建立一個陽性反應組組5，需要建立多個陰性對照組組1-組4來確認Test system中信號是和目標分子相關。這是一個十分重要，也是十分容易被忽略的問題。除了組5能夠得較高的陽性信號，其他分組如果得到較強的陽性信號，整個方法得到的數據都是不可信的。組3和組5（黃色）是ELISA實驗常用的對照組，但是組4（藍色）的缺席會使得整個方法充滿分險性，小編多個不同ELISA應用方法學開發的經驗表明，很多時候封閉劑起無法達到占據酶標板材空白位置的目的，反應配體或者反應配體中的非特異成分可能會直接吸附在酶標板材上，導致組4出現劑量依賴的假陽性信號。在雜交瘤和噬菌體展示篩選測定時，反應配體溶液的復雜和多樣性，使得配體溶液總會存在某些陰性抗體或者克隆能夠和酶標板材結合，成分組4的缺席會導致假陽性克隆出現的頻率大大增加。設置比較全的陰性對照組也有助于鎖定整個體系中哪些試劑發生了交叉反應，找到具體原因，方便更換試劑。 

2.包被受體相對于反應配體的劑量曲線。在確認Test system中陽性信號能夠代表目標檢測分子后，包被少量的受體，2倍梯度稀釋反應配體12-16個點進行全曲線擬合，選取EC80或者EC50的配體濃度作為競爭法反應濃度。如下圖所示100ng/ml 受體100ul包被，受體從100000ng/ml 2倍梯度稀釋到0.2ng/ml，采用不同稀釋濃度的酶聯抗體進行檢測，整個劑量曲線有明顯的上，下平臺期，不同的酶聯濃度對信號的線性傳遞未造成明顯的影響，酶聯抗體起到了等比例將信號放大的作用，EC50為12ng/ml，EC80為40ng/ml。可選取100ng/ml 受體100ul包被，配體的競爭濃度選EC80為40ng/ml，酶聯稀釋度選擇1：600以獲得較大的信噪比窗口，增加方法測量范圍。在競爭法實驗中EC80代表了配體在Test system中占據了受體80%的結合位點，配體和受體在此相對狀態下，樣品對配體和受體的反應的阻斷比較敏感。受體過多，可提供的結合位點較多，樣品和受體結合不會影響到配體和受體的結合；配體過多，樣品加入后相對于配體較少，競爭不過配體，絕大多數配體依舊和受體結合，在兩種情況下樣品的加入都無法導致Test system發生明顯的變化（配體受體偶聯物減少），信號變化不明顯。 

建立好完整的Test system后，就是正式建立競爭法的劑量曲線了。主要包含兩個方面的內容

1.將選定EC80濃度的配體和梯度稀釋的樣品（2倍梯度稀釋12-16個點）混勻后加入包被好受體的酶標板材反應，得到有明顯上下漸近線的全曲線，如下圖所示。 

2.根據實驗目的進行，選擇樣品合適的8個濃度梯度點進行實驗，簡化實驗操作流程，并初步評估方法的質量。具體到應用方面就是親和力大小比較和定量檢測方面。根據筆者的對比研究，發現ELISA競爭法相同條件下的同一個曲線在濃度點細微調整下能夠滿足兩方面的需求，這是筆者開創性的發現，希望業界更多的同行能夠進行驗證。下文會具體進行兩方面應用方法的初步評估。

當ELISA競爭法開發以親和力大小比較為目的，往往會以IC50值評價待測樣品阻斷配體受體結合效果，IC50越小，待測樣品的阻斷效果越好。親和力競爭法開發的劑量曲線應該有明顯的上下平臺期以得到較為穩定的IC50值。生物學活性的方法學驗證可參照USP1032, 1033,1034來進行實驗方案的設計和數據分析。具體到ELISA競爭法的方法學評價，即制備相對于對照品理論效價為156%，125%，100%，80%，64%的樣品進行檢測，通過比較對照品和樣品的IC50，得到樣品相對于實測效價，通過實測效價和理論效價的差異初步確認以親和力大小比較為目的的ELISA競爭法的質量。承接上文的全曲線選擇合適的8個濃度點，進行初步的方法學驗證的結果如下圖所示：該單次實驗如果進行多人和關鍵試劑的多批次實驗，得到的實測效價經過統計學分析將構成方法學驗證中最主要的幾個概念，精密度，準確度，線性和范圍。如結果顯示單次實驗結果實測效價和理論效價的差異在5%以內，能夠初步判斷該以親和力大小比較為目的ELISA競爭法有較好的方法質量。 

當ELISA競爭法開發以定量為目的，選取7個點以理論濃度為X軸，信號值為Y軸進行四參數函數擬合得到標準曲線，將對照品的信號值重新代入標準曲線可得回測濃度值，多次實驗統計分析后回測濃度值和理論值的偏差決定了該條標準曲線的檢測上限，檢測下限，測量范圍，更加詳盡的方法學驗證可參照2015版中國藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗證指導原則或者美國FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation相關論述。如下圖所示，對照品在12.5ng/ml-10000ng/ml較大的濃度范圍內，回測濃度值和理論濃度的偏差在20%以內，初步能夠判斷該方法具備較好的質量。需要說明的此定量方法的標準曲線僅僅是將親和力大小比較的劑量曲線刪除了上平臺期的最低濃度點。筆者大量的實踐表明定量方法的標準曲線明確的平臺期點會嚴重干擾標準曲線的定量準確性。

本文以ELISA競爭法方法學開發和初步方法學驗證的案例概論了功能學實驗和定量實驗的通用原則，包含以下幾個步驟：

1. 鑒于生物學方法的雙重間接性，明確檢測的目標分子，設置多個陽性對照組和陰性對照組，理清信號值和檢測目標分子的線性聯系；

2. 建立Test system，通過配體受體的結合實驗，尋找合適的配體受體相對濃度以得到樣品對Test system的敏感性；

3. 加入梯度稀釋的樣品進入Test system，繪制樣品相對于Test system的劑量全曲線；

4. 以實驗目的為導向，分別對親和力大小比較為目的和大分子定量為目的進行差異的濃度點選擇，并通過合規的方法學評價程序對方法的質量進行初步的評價。 

ELISA直接法和ELISA競爭法有相同的方法學質量評價程序和標準，即親和力大小比較的方法學質量評價程序和標準USP1032,1033,1034；定量分析的方法學質量評價程序和標準2015版中國藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗證指導原則或者美國FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation。ELISA競爭法在相同的實驗條件下對于對照品濃度點的微調可以完成親和力大小比較和大分子定量兩方面應用，這個有別于筆者之前的文章ELISA技術應用概覽和方法學開發初析對于ELISA直接法兩方面不同應用不同的實驗條件，但是兩類方法的四種應用均能夠通過驗證符合標準要求，只能說實踐出真知，不管白貓黑貓，能抓住老鼠的就是好貓了。

在體外所有的體外功能學實驗中，樣品引起檢測體系的變化，并以信號的形式展示出來，這個應該是體外生物學實驗方法最通用的原則，有結合才會有功能，功能是對藥物引起的變化（響應標志物）的準確定量。理解ELISA實驗關于結合和定量的應用以及方法質量評估標準對于所有的功能學實驗的開發和評價都有著十分重要的借鑒意義，ELISA里面有乾坤。

2012安進公司的科學家宣稱53項癌癥著名論文中有47項無法重復，在生命科學研究領域，在追求創新性，第一性的同時，臨床前研究結果可重復性差，這個值得我們從業者去反思，也許基礎研究領域需要借鑒藥物研發企業的一些經驗，做好生物功能學方法開發和方法學驗證的工作，在得到陽性結果前，先問一句，用來得到此陽性結果的實驗方法是否可靠？